基因修饰骨组织工程技术研究进展

许杰男 乔永杰 邹庆芳 马东洋

骨组织工程技术的三大要素为生物支架、种子细胞和生长因子，其中生长因子的应用方式主要为重组蛋白和基因修饰。重组蛋白应用是将成骨相关蛋白与支架复合后植入体内，其操作简单，不足之处在于价格昂贵且生物半衰期短，通常需要大剂量应用以维持长时间的作用，且超剂量外源性蛋白可导致异位成骨、毒性反应，甚至癌症的发生[1]。基因修饰骨组织工程（GMBTE）是将目的基因导入种子细胞内，利用细胞作为生长因子的发生器，使生长因子持续稳定地表达，此方式有望实现有效浓度下生长因子的持续局部表达[2]。由于可克服局部应用重组蛋白的缺点，GMBTE 在骨缺损修复重建治疗中展现出良好的应用前景。

本文围绕GMBTE 目的基因选择、载体选择以及基因投递方式进行综述，旨在为GMBTE 的转化应用提供理论基础。

1 目的基因选择

GMBTE 目的基因一般为表达生长因子的基因或调控生长因子表达的基因，靶基因通过表达生长因子来调控细胞的增殖、分化和基质分泌。

1.1 表达生长因子的基因

GMBTE 靶基因表达的生长因子包括骨形态发生蛋白（BMP）、血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子（TGF）- 和成纤维细胞生长因子（FGF）等。BMP 属于TGF- 超家族的分泌信号因子，在骨修复再生的所有阶段都发挥至关重要的作用，其中BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7 和BMP-9 的成骨能力较强[3]。VEGF 是功能最强大的促血管生成发育的生长因子，也可以通过趋化和促进成骨细胞分化来加速骨愈合[4]。上述生长因子基因以互补DNA（cDNA）或化学修饰信使RNA（mRNA）的形式应用于GMBTE 中，可在不同程度上提高骨缺损的治疗效果。

此外，多基因联合修饰拥有良好的协同作用，可在体内显著提高骨修复作用。负载共表达BMP-2 和FGF-2 的胶原支架可通过激活Smad 信号通路和细胞外信号调控激酶（ERK）信号通路，共同促进Runt 相关转录因子2(Runx2)转录以增强成骨[5]。BMP 和VEGF 分别是骨生成和血管生成的关键调节因子，BMP-2和VEGF双基因递送支架可显著促进血管化骨再生[6]。多基因修饰存在一定局限性，需进一步研究不同基因比例对骨缺损修复效果的影响。

1.2 调控生长因子表达的基因

调控生长因子表达的基因应用于骨组织工程技术时，可作为调控因子来调节多种生长因子的表达，主要包括转录因子Runx2[7]与Osterix（Osx）、低氧诱导因子(HIF)、信号素3A[8]、含LIM 结构域、半胱氨酸富集蛋白1[9]和微RNA (miRNA)等。Runx2 是BMP 信号通路下游端的转录因子，其过表达可上调非成骨细胞中多个成骨细胞特异性基因的表达；而Osx 是一种含锌指转录因子，作用于Runx2 信号通路下游。Runx2 和Osx 对成骨细胞分化和骨形成均至关重要。HIF 可启动血管生成-成骨级联反应，当机体缺氧时，HIF 作为上游调节因子可激活包括TGF-β、血管生成素1、干细胞因子和胎盘生长因子等数百个靶基因的转录[10]。miRNA 是小型非编码RNA，其发挥作用的机制尚不明确，可能是通过抑制特定mRNA 来调节各种生物过程。众多研究表明，miRNA 在成骨分化和骨再生中发挥重要作用[11-12]，是当前GMBTE 中靶基因研究的热点。

2 构建载体选择

GMBTE 技术需要将靶基因导入种子细胞并在较高水平持续表达一段时间，为了携带基因以及保护基因免受核酸酶和基因负电荷的影响，外源基因进入靶细胞通常需要借助载体。

2.1 病毒载体

病毒载体是将病毒的致病基因去除，保留其成骨或成血管基因。常见的病毒载体包括腺病毒（Ad）载体、逆转录病毒（RV）载体、慢病毒(LV)载体和腺相关病毒(AAV)载体等。Ad 载体的基因转染效率和表达水平较高，是最早应用于基因修饰的载体之一[13]。Ad 载体介导BMP[14-17]和HIF-1α[10]等基因可成功转入种子细胞并获得包括目的基因、相关mRNA 和蛋白质的高表达。Ad 载体携带的基因组游离于宿主基因组外独立表达，体内表达时间只有6 周左右，但足以诱导骨形成级联反应，并可避免长期分泌蛋白产生的不良反应。RV载体可将外源基因整合到细胞，实现靶基因永久的高水平表达，宿主细胞后代也可持续表达靶基因[18]。LV 是一种能够感染分裂和非分裂细胞的特殊逆转录病毒[19]。通过LV 载体可将 防御素3 和结缔组织生长因子成功转染入靶细胞，其转染效率稳定，并可获得目的基因的高表达[20]。AAV 载体携带的基因不会整合到宿主基因组，即使在高载体剂量下，其介导的基因转染也是相当安全的。但是，AAV 载体的制造成本高且纯度较低，若能克服这些缺点，其可成为GMBTE 最理想的载体。

病毒载体通常有进入细胞的自然倾向，因具有高转染效率成为GMBTE 中最常见的选择，但其安全问题应引起重视，如Ad 载体可引起宿主强烈的免疫反应和毒性反应[21]，RV 载体有激活细胞原癌基因而引发肿瘤的可能[18]，LV 载体也被报道可引起造血干细胞的恶性克隆扩增[22]。为了提高载体安全性，学者们采用消除载体中的病毒基因并使用特异性启动子减少细胞反应的方法[23]。近期，Bougioukli 等[24]将激活线粒体凋亡途径的诱导型半胱天冬酶9 基因插入LV-BMP-2 中，二聚化的化学诱导剂激活后可选择性地诱导转基因细胞凋亡，阻断骨形成。这种“自杀”式时空调控，可降低基因修饰相关不良反应和载体诱变基因突变的发生可能。

2.2 非病毒载体

非病毒载体具有制备简单、免疫原性低和毒性低的优点，通常可分为物理载体和化学载体。

2.2.1 非病毒化学载体

非病毒化学载体一般由基因与聚合物、脂质体或无机纳米粒子等组合而成。

聚乙烯亚胺(PEI)及其衍生物是体内和体外都有效的转染剂，被广泛应用于 GMBTE 中。PEI 是一种强大的阳离子聚合物，可通过“质子海绵”效应，促进基因内小体逃逸及DNA 转移到细胞核，被作为评价其他非病毒载体的“金标准”，但PEI 会破坏细胞膜而引起细胞毒性。近期的一项研究发现，高钙浓度下可溶性PEI 相互聚集，从而减少了破坏细胞膜的游离PEI，降低了PEI 的细胞毒性；同时，钙离子浓度为10 mmol/L 时可增强“质子海绵”效应，提高PEI 转染效率[25]。

脂质体可与细胞膜相融合，介导基因进入细胞内部。Nishikawa 等[26]对比了脂质体-质粒DNA、脂质体-RNA 和RV-DNA 3 种转染方式，发现脂质体-RNA 与RV-DNA 的转染效率相当，但脂质体-RNA 转染的基因表达时间更早，表达细胞数更多。脂质体-RNA 转染具有与病毒载体转染相当的转染效率，具有较高的安全性，同时其对目的基因片段大小和靶细胞生理状态的限制较低，是一种简单快捷的转染方式。

2.2.

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